技术服务

实时荧光定量PCR检测

        实时荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR反应进程，最后通过内参对照计算目的基因表达差异分析或通过标准曲线对未知模板进行定量分析，具有操作简便、快速高效、高通量、高敏感性等特点。 

qPCR的英文全名是Real-timeQuantitative PCR Detecting System。即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统，简称qPCR。

　　上世纪八十年代Cetus Corporation公司的化学家Kary Mullis发明了PCR，如今DNA扩增技术俨然已经成为了生物学研究的基础。三十多年以来，人们为了解决研究中出现的新问题新需求，不断对这一经典技术进行改良。从经典PCR、实时定量PCR再到现在的数字PCR，PCR技术在不断蜕变却从未淡出我们的视野。如今PCR技术早已走出实验室，在遗传学鉴定和疾病诊断中发挥着巨大的作用，在越来越广阔的领域里焕发着新的活力。

　　终点PCR是最原始、最简单的PCR方法，如今仍在被我们广泛使用。使用者只能在PCR反应结束之后，通过凝胶电泳、毛细管电泳等方法对产物进行检测。终点PCR本身是无法定量的，因为该反应产出的DNA量不一定能反映最初情况。举例来说，不同样品和序列的扩增效率是有差异的。

　　PCR的反应过程：

　　传统PCR电泳结果：

　　因此，研究者们克服了PCR定量分析的挑战——实时定量PCR（qPCR）。qPCR主要是利用插入性染料或荧光探针（比如TaqMan），人们可以通过监控PCR过程中的荧光强度比较多个样品的DNA水平。

　　在qPCR中使用插入性DNA染料，随着PCR循环的连续进行，这种染料的荧光强度会不断增强，从而可以使人们对反应中的DNA进行定量。利用荧光信号的变化，实时监测PCR扩增反应中的每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。

qPCR的特点

　　·灵敏度高

　　·特异性强

　　·全封闭PCR过程，无需后续处理

　　·及时反馈扩增过程，摒弃重点数据，更适用于定量

　　·定量范围宽，可达10个数量级，无需稀释样品

　　·可实现一管多检

　　·仪器自动分析，更快获得结果

　　qPCR的原理

　　·什么是Ct值？

　　PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。

　　·Ct值的重现性

　　Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值则极具重现性。

　　简单来说，模板DNA量越多，荧光达到阈值的循环次数越少，即Ct值越小；Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知拷贝数的标准品可做出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量。

　　qPCR定量分析，有绝对定量和相对定量两种。

　　·绝对定量：精确计算初始反应的模板浓度（DNA/RNA）

　　——病毒DNA或RNA的拷贝数

　　——转基因的拷贝数

　　·相对定量：计算初始反应模板的相对含量

　　——差异表达分析

　　——芯片评估

　　——转基因生物的检测

　　——基因型检测