技术服务

胞内细胞因子检测

随着研究的进展，仅仅对细胞进行定量和活性的检测已不能满足需要。在单细胞水平研究细胞因子的表达能力对研究细胞因子在疾病中的作用越来越显的重要无比。目前检测单个细胞特定细胞因子的表达手段包括：ELIspot、原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析（limiting dilution analysis，LDA）和单细胞PCR，应用原位杂交技术和免疫组化方法观察细胞因子蛋白表达及mRNA表达可以识别Th1和Th2细胞，此方法可获得较强的细胞内信号，但此方法工作量大、主观性强，难以进行大样本检测，且人肉眼识别能力有很大的局限性，而ELISPOT及单细胞PCR技术，技术性强、劳动强度大，难以进行广泛推广。随着多标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现，使对细胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段。下面主要对胞内细胞因子流式细胞技术作以介绍。

早期细胞因子表达与细胞功能相关性研究是基于特定克隆">克隆细胞的激活。尽管研究应用T淋巴细胞克隆">克隆证明了不同细胞因子的合成，如TH1（IL－2，IFN－）与TH2（IL－4，IL－5，IL－10），但这些研究很难外推，因为T细胞克隆">克隆与体内T细胞功能相关性还未被揭示。

近来，Jung与Picker采用了monensin、PMA等药物预孵，用Brefeldin（BFA）、Monensin阻断了胞内高尔基体介导的转运的方法使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。因为自然状态下，T淋巴细胞产生少量的细胞因子，通常要对T淋巴细胞体外活化进行研究。在体外刺激过程中，T淋巴细胞产生的细胞因子已释放出来，胞内细胞因子信号较弱，难以进行检测。这一方法可检测单个细胞内多个细胞因子，并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群。在细胞水平该方法证明了人与鼠的淋巴细胞都存在1型与2型分化，且这些分化在特定细胞因子增强时可被逆转。且这些研究清楚地证明，只有激活的细胞亚群可以表达细胞因子，静止的正常淋巴细胞（T、B、NK）不能分泌细胞因子。

胞内流式分析法是用抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志组合，即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌，同时采用特殊的化学与抗体选择，确保静止与无细胞因子分泌细胞的最小荧光背景。具有其它方法难以比拟的优点：

快速：流式定量检测细胞内细胞因子可在一天内完成，实验流程需6-8小时，实际操作时间为1-2小时，快速简便；

简便：无需组织培养，可以全血分析，无需分离PBMCs；

灵敏度高：高度灵敏的荧光标记与检测系统；

高效：可以在同一个细胞内同时检测两种或更多种细胞因子，也可根据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞的亚型，进行多参数相关分析；

安全：减少样本处理与生物源性污染

流式检测细胞染色基本过程（以全小鼠脾脏为例）

1、收获细胞

将小鼠脾脏取出，研磨过滤，得到单细胞悬液。加刺激剂，同时加蛋白转运抑制剂（参照说明书）， 混匀后，37℃，5%二氧化碳培养4-6小时

2、阻断Fc受体

用于消除非特异性的结合染色

① 在小鼠，可使用纯化的FcII/III受体的抗体（CD16/32），按照1ug/106细胞的用量，在染色缓冲液中4℃孵育15分钟，PBS清洗后，直接进行下一步染色。

②对于人和大鼠，可直接使用过量的与荧光抗体相同来源和亚型不相关的纯化Ig或者血清进行阻断

3、细胞表面染色

① 加适当的细胞表面染色试剂

② 加入溶血素，室温暗处孵育10分钟。（注意：PMA激活的全血可能会溶血不完全。）

③离心500g 5分钟，弃上清

4、固定和破膜

① 加固定剂，室温暗处孵育15分钟，离心500g 5分钟，弃上清；

② 加破膜剂温暗处孵育10分钟。（剂量参照说明书）

③ 加23mLPBS洗液，离心500g 5分钟，弃上清。

5、细胞内染色

① 加入荧光标记的细胞因子抗体，混匀，室温暗处孵育30分钟。

② 加2、3mL洗液，离心500g 5分钟，弃上清，加入500LPBS上机或加入500 L 1% PFA固定后再上机

6、检测结果

小鼠脾脏淋巴细胞培养处理，经PMA和离子霉素刺激4h，高尔基体转运阻断后，分别标记表面抗原、固定破膜、胞内和核内抗体标记，流式分析得到Foxp3+调节性Treg细胞、IL-17/IL-10/IFN-r分泌性T细胞的百分比。