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肿瘤浸润免疫细胞检测

肿瘤中数量最多的细胞是肿瘤细胞，免疫细胞的比例只能占到其中很小的一部分，因此如何高效率的分离肿瘤浸润的免疫细胞成了实验的关键，所幸，目前我们已经试验过了一套可以高得率提取肿瘤浸润免疫细胞的protocol，实验操作分为肿瘤分离、制备肿瘤细胞悬液，percoll分离免疫浸润淋巴细胞，细胞染色，上机分析这五个部分。

   肿瘤分离

1. 采用颈椎脱臼法将荷瘤小鼠处死，放置于含有75%酒精的烧杯中，浸泡30s。

2. 左手持镊子，右手持弯剪，沿肿瘤边缘剪下长约1cm的口子，可清晰看见肿瘤附着于皮下，沿着肿瘤边缘轻轻剪开连接处，剥离肿瘤。

3. 将剥离的肿瘤放入100mm的培养皿中，并在室温下加入5-10 ml的HBSS。

注：肿瘤体积一般不超过1000mm3，肿瘤质量在0.6-0.8g之间。

   制备肿瘤细胞悬液

4. 待所有肿瘤剥离完毕后，将肿瘤转移至1.5ml EP管中，手持弯剪将肿瘤剪碎。

5. 将肿瘤组织悬液转移到50ml离心管中，用适量HBSS冲洗EP管，并将悬浮液转移到离心管中。管中的总体积为45ml。

6. 在管中加入5ml 10×Triple Enzyme Mix，在摇床上以80rpm、37℃的条件消化1-3小时。

7. 消化完毕后，50g，10min离心，收集上清，则为肿瘤细胞悬液。

注：剪刀剪碎肿瘤的标准为，其可被1ml的枪头自由吸取，无阻碍。

10×Triple Enzyme stock solution (100 ml)

在80 ml HBSS中混合1 g Collagenase IV, 100 mg Hyaluronidase和20,000 Units DNase IV，添加HBSS至100ml。使用0.22μm的滤器进行过滤，分装成5ml储存在-20℃，使用前恢复至室温。

   Percoll分离免疫浸润淋巴细胞

8. 200×g，5min离心上清，加入10ml HBSS重悬，将其转移至15ml离心管中，200g，5min再次离心，用40% percoll重悬细胞。

9. 在新的15ml离心管中提前加入4ml 80%percoll，再用巴氏滴管小心的沿壁将4ml含肿瘤细胞的40% percoll沿壁加在80%percoll的上面。

10. 350g，30min离心（升速=1，降速=0），40% percoll与80% percoll交界处则为免疫细胞。

Fig 2. 不同浓度的percoll分离免疫细胞

04 细胞染色

11. 收集细胞，加入10ml PBS 350g，5min离心。

12. 100μl PBS重悬，转移到1.5ml EP管中，进行封闭。

13. 使用相应的抗体，与细胞一起共孵育。

   上机分析

细胞分析的marker表达：

多色流式分析淋巴系亚群（T/Th/Tc/B/NK/Treg）的比例。