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双荧光素酶实验

       荧光素酶报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物来检测荧光素酶活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光(bioluminescence)。然后可以通过荧光测定仪（化学发光仪）测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光。荧光素和荧光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。

       双荧光素酶体系，即有两种荧光素酶，比较常见的组合是萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶，萤火虫荧光素酶作用于甲虫荧光素，而海肾荧光素酶在氧的存在下作用于海肾荧光素。以其中一个作为内参对照，即表达量基本恒定，用于减少试验中不同处理间所固有的变化，包括培养细胞的数目及活力的差异，细胞转染及裂解的效率，而另外一个荧光素酶则作为报告基因，用于指示不同处理条件下基因的表达情况。

将目的基因转录调控原件构建入带有荧光素酶(Firefly luciferase)的表达载体，构建成报告基因质粒，使这段序列调控luciferase的转录表达。然后将报告基因质粒转染细胞，给予其不同的处理后裂解细胞，并加入底物荧光素(luciferin)，luciferase可催化luciferin发出荧光(最强波长在560nm左右)。检测得到的荧光值高低可以判断不同处理组对该转录调控原件的影响。为避免由于质粒转染细胞时效率差异所造成的误差，通常会转入Renilla luciferase的报告基因质粒作为内参(最强波长在465nm左右)，即双荧光报告系统。

双萤光素酶实验的具体步骤

1、报告基因质粒的构建。将目的片段插入到荧光素酶表达的报告基因载体上，如pGL3-basic。

2、转染细胞。将报告基因质粒和phRL-TK(内参)共转染细胞，根据需要对细胞进行处理。共转染时，由于内参具有很强的启动子，因此报告基因质粒：内参转染量一般为10:1~50:1。

Luciferase活性测定：

⑴ 初次使用时，配制LAR II，即Firefly luciferase的底物。将LAR II溶解在LAR II buffer中，并分装-80℃避光保存。

⑵ 加入1X PLB，室温裂解细胞15 min。

⑶配制Stop&Glo，即Renilla luciferase的底物，能够终止LAR II的反应。

⑷ 测定荧光值。向40 ul的LAR II中加入10 ul细胞裂解液，吹打混匀后，检测读数，即为Firefly luciferase的值。加入40 ul Stop&Glo，再次读数，即为Renilla luciferase的值。

⑸ 数据处理。首先计算出每管的Firefly luciferase/Renillaluciferase的比值，再以control组的比值为单位1，即可得到不同处理组的相对luciferase活性，也就是该处理组基因转录的调控活性。

实验注意事项

1、为保证荧光素酶检测试剂的稳定性可以采取适当分装后避光保存的方法，以免反复冻融和长时间暴露于室温。

2、为取得最佳检测效果，同一批样品最好保证相同的测定时间，通常为10 s。