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细胞周期

细胞周期（cell cycle）是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，分为间期与分裂期两个阶段。

细胞周期检测 

细胞周期可以分为G0/G1期二倍体、G2/M期四倍体和DNA复制的S期，核酸染料如PI、DAPI等染色后，不同时期的 细胞插入的核酸染料含量不同，流式检测后根据荧光强度的不同，能检测到二倍体、四倍体和S期细胞的百分比。 

 细胞株消化后70%乙醇固定过夜，RNase/PI染色液孵育半小时后，流式检测到cell cycle百分比。

 细胞株经不同处理后，PI染色分析细胞周期，处理组明显有细胞增殖和四倍体阻滞现象。

G0/G1期：G1期，细胞体积逐渐增大，细胞开始RNA和蛋白质的合成，DNA含量保持二倍体状态，G0期是脱离细胞周期暂时停止分裂的一个阶段。但在一定适宜刺激下，又可进入周期，从 DNA含量上无法区分G0与G1期；

S期：在这一阶段完成DNA的合成以及合成与DNA组装构成染色质等有关的组蛋白。DNA含量在此时期增加，介于G1期和G2期之间；

G2/M期：G2期是DNA复制结束和开始有丝分裂之间的间隙。从DNA含量上同样无法区分G2期和M期。

PI/RNase染色法技术原理

检测细胞周期最常用的方法就是检测细胞DNA含量，正常生长的细胞都会经历分裂过程，G0/G1期是两倍体时期，S期DNA开始合成，到G2/M期，细胞处于四倍体时期，之后细胞一分为二，进入下一个细胞周期。

碘化丙啶(Propidium ，简称PI)是一种双链DNA的荧光染料。碘化丙啶和双链DNA结合后可以产生荧光，并且荧光强度和双链DNA的含量成正比。细胞内的DNA被碘化丙啶染色后，可以用流式细胞仪对细胞进行DNA含量测定，然后根据DNA含量的分布情况，可以进行细胞周期和细胞凋亡分析。

实验方法（以悬浮细胞为例）

1、离心收集细胞，弃上清，用预冷的PBS洗涤2次；

2、细胞固定：用残留的少许PBS混匀沉淀，缓慢加入-20°C预冷的70%乙醇，边加边摇匀，避免细胞粘连在一起，置于-20°C冰箱固定4h以上；

3、细胞染色：350g离心5min，弃上清，用2ml的PBS洗涤2次，按照10^6 cells 加入500μlPBS，含50μg/ml的 PI，100μg/ml的RNaseA，4°C避光孵育15min-30min（可将PI直接用PBS配成工作浓度，RNaseA现加进去）；

4、上机分析：由于PI具有很强的粘附性，容易使细胞聚团，建议过滤后再上机分析，同时别忘了检查流式仪器的状态，一般低速收集2-3万个细胞即可。

技术总结

1、PI既能与DNA结合，又能与RNA结合，所以要用RNase消化RNA；

2、进样速度：进样速度为低速。若峰形较宽，可能就是进样速度太快；

3、仪器质控定期做，尽可能排除因机器设置引起的峰形加宽；

4、排除粘连细胞（FL2-A/FL2-W），最大程度的减少粘连细胞带来的假阳性结果。

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