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细胞凋亡

细胞凋亡通常称为细胞程序性死亡，是由基因控制的主动性细胞死亡过程。越来越多数据发现，细胞凋亡与多种疾病密切相关，如癌细胞具有连续增殖、抵抗细胞凋亡能力，利用流式细胞仪分析细胞凋亡可为肿瘤诊断，疗效评价和预后预测提供了重要的参考指标。

细胞凋亡(apoptosis)是一件主动性细胞死亡事件，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控，是细胞为更好地适应环境而主动争取的一种死亡过程。具体表现为：出芽形成凋亡小体、核小体间DNA的切割，凋亡小体被吞噬和消化等几个连续过程等。

一、流式检测细胞凋亡的原理

Annexin V和PI双染法是流式检测细胞凋亡的经典方法，该方法简便、快速、准确区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞，具体原理如下：

Annexin Ⅴ（膜联蛋白 V）是一种分子量为35-36 kDa的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合，将Annexin V 进行荧光素FITC标记，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

碘化丙啶（Propidium, PI）是一种可与DNA结合的染料，它不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核红染。

因此，将Annexin V与PI联合使用时，便可用来鉴别活细胞，凋亡细胞及死亡细胞。

二、实验操作步骤

收集细胞：取适量的对数生长期细胞接种于6孔板中，在相应的条件下（如药物）处理相应时间后，收集细胞，注意要合并上清和消化下来的细胞（注：悬浮细胞直接离心即可）；

清洗细胞：用预冷的PBS洗2遍细胞；

分组：每一次实验分为不染组、单染Annexin V组、单染PI组以及PI和Annexin V双染组，处理组按从低到高进行双染；

染色：用PBS把4×binding buffer稀释到1×缓冲液，吸净离心管残余的PBS后，每管加入100μL的1×的binding buffer，用移液枪吹打细胞使细胞充分重悬，避光条件下加入染料。不染组不加，单染组加Annexin V或PI 5μL，Annexin V和PI双染组加入Annexin V 和PI各5μL，并用移液枪轻轻混匀；

上机检测：室温避光孵育15分钟后，加入1×的binding buffer 300μL并混匀后避光下将细胞悬液转移到5mL的流式管中，1h内在流式细胞仪上机检测。

左图为Annexin/PI双染法测凋亡，左下象限为活细胞，右下象限为早期凋亡细胞（早期凋亡细胞外翻的PS 能和探针Annexin V特异性结合），右上为晚期凋亡和坏死细胞，左上为彻底死亡的细胞。右图为JC-1染色检测 凋亡，选择绿色FITC和红色PE通道检测JC-1荧光，正常细胞膜电位正常，JC-1为多聚体状态发红光，细胞发生 凋亡时，线粒体膜电位去极化，JC-1变成单体状态发出绿色的光，通过红光和绿光的偏移反应线粒体的膜电位变化。

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