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流式分选实验常见问题

特别提醒：

1、 分选过程中会产生气溶胶，有生物危害的风险，所以不接受有生物安全性问题的标本;

2、 特别粘稠，过滤后仍然产生沉淀的标本，不适合做分选实验；

3、 如需取消实验，请提前4小时电话通知，未及时通知需收取开机费用；

4、 分选过程有污染的风险，珍贵标本或细胞株请做好保种工作；

5、 因为要保证仪器管路无菌，所有标本均需无菌准备。

常见问题

Q1. 通常做一次细胞分选需要多久时间？

分选仪器进样速度一般为10000个细胞/秒，所以理论一个小时能分选3.6*10e7个细胞。如果细胞碎片很多，分选时间会增加。分选时间还包括仪器液流调试时间、分选前流式检测设门时间以及标本之间仪器清洗时间。

Q2. 需要准备多少细胞去做分选？

总细胞数由目标细胞的百分比和分选得率决定，具体参考下面公式：

目标细胞数=总细胞数×目标细胞百分比×回收率

分选是一个高速高压的过程，中间会伴随着细胞的丢失，导致回收率降低。如果希望分选后得到1×10e6的细胞，假设目标细胞的百分比是10%，分选的回收率为参考值50%，1*10e6=10% × 50%× 20*10e6，所以需要准备2*10e7个细胞。当然，得到的1×10e6个目标细胞还包括部分死亡的细胞，这也是分选准备时需要考虑的因素（分选活性）。

Q3. 分选标本需要重悬在什么样的缓冲液里？细胞浓度应该多少合适？

建议标本浓度为2*10e7/ml，缓冲液可用含1-2% BSA的PBS或者HBSS溶液，易黏连的细胞可以加入5mM EDTA螯合剂，死细胞较多的标本可以加入10U/ml的DNase I。某些细胞浓度较高时容易结团，可适当稀释，这样相应的分选时间会增长。如果某些细胞需要重悬在RPMI等培养基中，建议不要含酚红或生物素。分选标本放在12×75mm的流式管中，冰上运输，保持细胞活性。

Q4. 接收管应该怎么准备？

准备流式管或15mL离心管作为接收管，提前多加点培养液（含20% FBS、双倍的PS双抗或者庆大霉素）作为缓冲。接收超过5*10e6个细胞建议用15mL离心管。建议多准备几根接收管。

Q5. 如果细胞要再培养，会污染吗？

分选仪器和分选房间都会提前消毒，分选获得的细胞建议：低速离心去除上清、更换含二倍浓度抗生素的培养基、培养一至两天正常后更换正常培养基。

备注：传统的青霉素和链霉素可能不够，选择三抗如Antibiotic-Antimycotic（ThermoFisher Cat.15240062），含青霉素、链霉素和两性霉素B（抗真菌），甚至可以再多加庆大霉素（广谱抗生素）。

Q6. 一个样品可以同时分选出几种细胞?

一般是两路，四路分选和96孔板分选预约时请特别备注。

Q7. 分选后细胞的纯度有多少？

通常可以达到95%以上的纯度，如果目标细胞百分比很低、或者目标群体分群不明显，会导致分选纯度下降。

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