实验指南

流式对照设置

流式实验中对照设置很重要，常见的有阴性对照、FMO对照、补偿单阳管对照。

（1）阴性对照：

每一种细胞都会产生非特异性荧光，流式检测时得到的荧光信号是细胞本身的非特异性荧光和来自于细胞表面结合的荧光素的特异性荧光叠加得到的结果。所以，确定与荧光素无关的细胞自身的非特异性荧光的强弱非常重要，此时就需要设立阴性对照。下图3类阴性对照是比较全面的阴性对照，但我们实验中设置阴性对照不需要3种阴性对照全部设置齐全，一般只需要设置1种阴性对照就可以了，推荐第1类或第3类。

①第一类"negative"表示的是不加任何荧光素偶联抗体时得到的荧光信号，即“blank”因为没有标记任何荧光素，所以这组得到的荧光信号与荧光素无关，与细胞抗原分子是否表达无关，得到的荧光信号代表的是非特异性荧光信号（当实验要求不高、已进行预实验或者能够确定同型对照的荧光信号与不加同型对照的这种阴性对照结果一致时，就可以采用这种阴性对照的设置）；

②第二类"抗CD69"表示的是用抗CD69抗体标记样品细胞后得到的荧光信号，虽然抗CD69抗体能够与细胞表面的CD69抗原分子结合，但是抗CD69抗体没有偶联荧光素，所以得到的荧光信号也与细胞表面是否表达有CD69分子无关，得到的荧光信号代表的也只是细胞本身的非特异性荧光，所以这种对照用于排除抗体的影响（第2种阴性对照设置方法只是一种理论上的设置方法，是为了便于理解阴性对照的设置原理，一般流式分析时不会应用到这种阴性对照）；

③第三类"IgG1-PE"表示的是标记与抗CD69抗体同种属（来源于同一物种）且同类（抗CD69-PE中的抗体是IgGl类的）的非特异性抗体(IgGl)与PE荧光素偶联的同型(isotype)对照抗体(IgGl-PE)后，得到的荧光信号，这种同型对照抗体不能与细胞表面的CD69 发生特异性结合，所以细胞表面不会结合有IgGl-PE, 最后得到的荧光信号不是PE荧光素产生的特异性荧光信号，而是代表细胞本身的非特异性荧光，所以这种对照用于排除荧光素的影响（第3种阴性对照的设置方法，称为同型对照设置，是常规的阴性对照设置法，正式的流式图的数据都必须建立在这种同型对照的基础之上，在同型对照基础上得出的流式结果是最可靠的，尤其是对于一些阴阳分群不明显的情况下，可将同型对照作为划门的依据）。

（2）FMO（fuorescence-minus-one control）对照：

即减去一个荧光抗体（一般是表达量低、背景荧光干扰强），其它组合不变，是一种特殊的阴性对照，多在研究不同细胞亚群表达某些重要的表型分子、细胞因子等时应用。如Foxp3 FMO，也就是不加Foxp3-PE，只加入CD4、CD25，与三个染料都加组相比，多出来的那部分就是Treg细胞群。

（3）补偿单阳管对照:

以上面我们提到的CD3-APC、CD4-FITC为例，在这里，我们要设置PE单染管和FITC单染管，用于补偿的调节，一般单染管要求有明显的阳性细胞群，像CD3、CD4表达量都很高，阳性细胞群明显，但对一些抗原表达弱的情况（阳性细胞群基本看不到），例如CD25，这时候有必要借助补偿微球。

总结常见对照的作用作用

阴性对照- negative、全染调节FSC/SSC及荧光通道的电压

补偿单阳管对照调节补偿

阴性对照-同型(isotype)对照精准圈门

FMO对照精准圈门