实验指南

流式细胞术

流式细胞术（flow cytometry，FCM）是利用流式细胞仪对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒同时进行多参数、快速定量分析和分选的高新技术。其特点是:第一，只要样本制备成单个细胞或生物颗粒悬液均可以分析。第二，测量速度快，每秒中可以测量数千个乃至数万个细胞。第三，同时测量每个细胞的多参数特征。第四，在进行细胞特征分析的同时可以把指定特征的细胞分离出来，以便对特定细胞做进一步培养、克隆化、观察或进行某些实验，这就是分选技术。

1、首先制备单细胞悬液

将待测细胞或微粒制成单细胞悬液，经特异性荧光染料标记抗体进行染色，在恒定气体的压力下进入流动室，不含细胞或微粒的缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流形成一定角度，鞘液包绕着样品高速流动，组成一个圆柱形的液流束，待测细胞或微粒在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。

2、其次，收集单细胞上的荧光号

流式细胞仪通常以激光作为发光源，经过聚焦整形后的光束垂直照射在样品流上，细胞或微粒上的荧光染料被激发，产生散射光和激发荧光。光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。

3、再次，统计结果

荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原强度或细胞内物质的浓度，经光电转换变为可被计算机识别的数字信号。计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机上。

4、最后，做细胞分选

细胞的分选是指根据其物理或荧光特征进行细胞的分离和收集。细胞经过激光照射区之后，细胞分选仪可以生成含有单个细胞的液滴。每个液滴被充电，然后利用电场使其偏转至各类收集管或多孔板中。这些富集的细胞可用于后续实验，例如细胞培养或者测序等等。

图1:流式细胞仪的工作原理

流式细胞术动用了现代多科高技术，能够同时定量检测检测单个细胞的多项指示，显示出无比优越性，已经广泛应用于细胞生物学、免疫学、临床医学、基础科学研究、海洋生物以及分选应用等研究领域。

这么高级的单细胞统计仪器，到底能做哪些实验呢？

比如，细胞计数标记可以帮助分析细胞，我们以此为例说明流式细胞仪的应用。

细胞周期检测

图2：细胞株消化后70%乙醇固定过夜，RNase/PI染色液孵育半小时后，流式检测到cell cycle百分比。

图3：细胞株经不同处理后，PI染色分析细胞周期，处理组明显有细胞增殖和四倍体阻滞现象。

细胞周期可以分为G0/G1期二倍体、G2/M期四倍体和DNA复制的S期，核酸染料如PI、DAPI等染色后，不同时期的 细胞插入的核酸染料含量不同，流式检测后根据荧光强度的不同，能检测到二倍体、四倍体和S期细胞的百分比。

细胞增殖实验

图4：EdU/PI 双染法检测细胞增殖，不仅能得到 G0/G1/S/G2/M 期的百分比，还可以和其他抗体一起染色，得到 某特定亚群细胞的增殖百分比。

图5 CellTrace染色检测淋巴细胞增殖实验。CellTrace Violet染料标记细胞后，随着细胞的增殖，CellTrace Violet染料会均匀的分到子代细胞中，流式图中能看到荧光强度减弱的峰，峰的个数大概能代表细胞增殖的代数。

细胞周期实验能观察到细胞的增殖情况，流式还可以通过BrdU/EdU的方法进一步观察各个期的百分比，也可以 利用CFSE、CellTrace等染料观测细胞的增殖代数。

好了，今天就到这里了，这些只是基本的流式细胞仪的分析原理和使用，流式细胞仪的使用可以更深更广，想了解更多相关知识，请继续关注我们吧！