实验指南

细胞凋亡通常称为细胞程序性死亡，是由基因控制的主动性细胞死亡过程。越来越多数据发现，细胞凋亡与多种疾病密切相关，如癌细胞具有连续增殖、抵抗细胞凋亡能力，利用流式细胞仪分析细胞凋亡可为肿瘤诊断，疗效评价和预后预测提供了重要的参考指标。然而很多实验的同学们，常会碰到上机检测时细胞死亡太多却检测不出凋亡，多次重复结果不一致等现象，本文就一起看看如何把细胞凋亡的数据变的更加漂亮，准确！

首先，明确一下细胞凋亡和坏死的区别

细胞凋亡(apoptosis)是一件主动性细胞死亡事件，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控，是细胞为更好地适应环境而主动争取的一种死亡过程。具体表现为：出芽形成凋亡小体、核小体间DNA的切割，凋亡小体被吞噬和消化等几个连续过程等[1]。细胞坏死（necrosis）则是一件被动的过程，是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程，即病理条件下，自体损伤的一种现象。具体表现为：细胞胀大，胞膜破裂，细胞内容物外溢，核变化较慢，DNA降解不充分，会引起局部严重的炎症反应。

一、流式检测细胞凋亡的原理

Annexin V和PI双染法是流式检测细胞凋亡的经典方法，它是基于凋亡的早期细胞膜上的磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine, PS）从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面这一原理来实现的。

该方法简便、快速、准确区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞，具体原理如下：

Annexin Ⅴ（膜联蛋白 V）是一种分子量为35-36 kDa的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合，将Annexin V 进行荧光素FITC标记，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

碘化丙啶（Propidium, PI）是一种可与DNA结合的染料，它不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此，将Annexin V与PI联合使用时，便可用来鉴别活细胞，凋亡细胞及死亡细胞。

二、实验操作步骤

1、收集细胞
收集细胞｛数目约（1~ 5）x106个/mL｝，500~ 1 000 r/min离心5 min，弃去培养液。 

2、细胞洗涤
3 ml PBS洗涤1次。

3、乙醇固定
离心去PBS，加入冰预冷的70%的乙醇固定，4℃，1-2小时。

4、细胞重悬
离心弃去固定液，3 mlPBS重悬5 min。

5、细胞过滤
400目的筛网过滤1次，500-1000 r/min离心5 min，弃去PBS。 

6、染色
用1 ml PI染液染色，4℃避光30 min。

7、流式细胞仪检测
PI用氩离子激发荧光，激光光波波长为488 nm，发射光波波长大于630 nm，产生红色荧光分析PI荧光强度的直方图也可分析前散射光对侧散射光的散点图。

三、数据分析

Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒是用FITC标记的Annexin V作为探针，FITC最大激发波长为488 nm，最大发射波长525 nm，FITC的绿色荧光在FL1通道检测；PI-DNA复合物的最大激发波长为535 nm，最大发射波长为615 nm，PI的红色荧光在FL2或FL3通道检测。通过软件分析，绘制双色散点图，FITC为横坐标，PI为纵坐标。

如下图所示：细胞可以分为4个象限：

图2：4个象限的细胞分布图

Q1：左上象限（UL）为（Annexin V-/PI+），可能是已经没有细胞膜的细胞碎片，或者其他原因导致的死亡细胞；

Q2：左下象限（LL）为正常（活）细胞（Annexin V-/PI-）；

Q3：右上象限（UR）为晚期凋亡细胞（Annexin V+/PI+）；

Q4：右下象限（LR）为早期凋亡细胞（Annexin V+/PI-）。

四、常见问题及注意事项

实验过程中的小建议（大作用）：

1） 要准备阴性对照（不加染料）、阳性对照（同时加两种染料）和单染样品（分别只加一种染料），阳性对照和单染样品细胞可以55℃水浴10min或用凋亡诱导剂诱导细胞凋亡。

2）收集细胞上清，因为凋亡的细胞可能会脱壁，悬浮于培养基，所以必须收集上清再离心取沉淀，合并胰酶消化下来的细胞，不然检测出来的凋亡比例可能会减少。

3） 细胞凋亡检测的是活细胞，切勿用甲醛固定，尽量避免酶消化时间过长或用力吹打产生细胞碎片，重悬细胞后尽快上机检测。

4） Annexin V的结合依赖于钙离子，所以消化液中避免含有EDTA，否则会影响Annexin V与PS的结合。

5） Annexin V的结合不稳定，所以需要在标记时确保使用含钙离子的缓冲液，并且在半小时内上机检测。

6） 如果细胞本身表达GFP或转染了表达GFP的质粒，就会干扰FITC荧光信号，需选择其他荧光标记的Annexin V，如Annexin V-PE，并且染色过程注意避光操作。

设置对照样本：

凋亡双染我们一般要设置哪些对照样本呢？在我看来，至少推荐大家做如下3种对照：

1. 空白对照：辅助判断管，即不加Annexin V/PI，但用它调电压的话，电压偏高，即根据它确定的阴阳性界限是偏低的。

2. 阴性对照：未诱导凋亡的样本，同时加入Annexin V/PI双染，此时细胞绝大部分都在双阴性区域，用它来确定两荧光通道的电压，这是为了排除非特异性结合。

3. 单阳样本：诱导凋亡的样本，分为2管，单独染色Annexin V和PI，用来调后续的补偿

样本制备的2个关键点：1. 减少样本的假阳性：由于任何细胞损伤都会导致AnnexinV呈现阳性，所以在凋亡样本的制备时，对细胞膜损伤要尽可能降低到最小，包括：细胞接种密度不易过密，尽可能充分而不过度的消化贴壁细胞；离心的转速不应高于300g，不使用涡旋仪高速涡旋混匀细胞，操作尽量轻柔等；2. 避免染色出现假阴性：由于AnneixnV这个探针需要有钙离子存在于细胞表面时才能着色，所以我们要避免一切洗脱细胞表面钙离子的因素，例如使用含EDTA的酶，或是检测血样时使用紫头采血管等。

其他注意事项：消化是关键步骤，注意消化时间和操作力度，过短的话细胞需要用力吹打才能脱落，容易造成膜损伤，过长又易造成假阳性；Annexin V-FITC和PI是光敏物质，在操作时请注意避光；避免洗涤时细胞损失过多，可考虑在吸液时用大的Tip头套上小的Tip头吸液；上机检测时，必须重悬成细胞悬液后再检测，否则容易堵仪器管道；如果细胞过多或聚团严重，可先用300目（孔径40~50微米）尼龙网过滤，然后再上机检测；注意：FITC为绿色荧光，此检测方法不适用于已带绿色荧光标签的细胞；

如果样品来源于血液，请务必除去血液中的血小板。因为血小板含有PS，能与Annexin V结合，从而干扰实验结果。