实验指南

流式配色及抗体选择基本原则

随着流式细胞术应用领域的日益广泛，流式抗体及荧光标记产品的种类、数量也在不断增多，加上多色分析实验方案需求的增长，逐渐产生了抗体难选择、荧光难搭配等问题，给实验顺利开展带来了诸多困扰。流式抗体如何选择，如何配色也成为了流式技术是否能被成功应用的关键因素之一。

多色流式实验如何配色呢？

任何发荧光的物质分子都具有这两个特征光谱

第一个是激发光谱（Excitation，Ex）：– 是指能特异性地激发某种荧光素的一定波长范 围内的光线，也称为吸收光谱。– 吸收波峰（最大吸收波长）。

第二个是Ex-Max 发射光谱（Emission）：– 是指某一波长激发光引起荧光素发射的一定波 长范围内的荧光。 发射波峰（最大发射波长）：Em-Max 发射波峰--最大发射波长。

首先要了解流式仪器的参数配置：

以双激光的流式细胞仪为例

第一、抗体配色注意强弱搭配

荧光本身有强弱之分，可视抗原表达强弱及分群情况选择合适的荧光。

高水平表达的抗原+弱荧光基团；低水平表达的抗原+强荧光基团

如抗原表达弱或分群不明显的建议选择强荧光PE ；反之，抗原表达强或分群明显的建议选择最常用的弱荧光 FITC 即可（常用荧光强弱排序为：PE>APC>PE-cy5>Percp-cy5.5>FITC ）；

第二、选择干扰少的荧光组合

染料之间可能存在荧光重叠，应该尽量避免。由于荧光素的宽发射谱特点，荧光通道间有光谱重叠现象，多色流式实验的时候需要通过补偿调节消除光谱重叠影响。

第三、谨慎使用串联染料

串联染料再复杂多色实验中非常必要，光照和固定都容易导致其降解，注意标准化操作以避免降解引起的实验问题（如PE/Cyanine等串联染料容易因光照而降解）

以下是常见的多色荧光抗体搭配

经典3色：FITC、PE、APC

经典4色：FITC、PE、APC、PerCP/Cyanine5.5

经典5色：FITC、PE、APC、PerCP/Cyanine5.5、PE/Cyanine7

经典6色：FITC、PE、APC、PerCP/Cyanine5.5、APC/Cyanine7、PE/Cyanine7

第四、酸性缓冲液和固定步骤对部分染料具有破环性

固定或者长时间的孵育对串联染料影响明显，FITC对低PH环境敏感。

第五：抗体的使用与保存（尽为参考，请尽量参见厂家产品说明书）

1、抗体使用的建议

① 建议实验细胞的数量和抗体的比例要适当。细胞过量或抗体过量都可能使实验结果受影响，因此需要优化试验条件

② 以test 为计量单位的抗体，按照总体积计算出每次加入多少 ul 抗体即可；

③ 以 ug 为计量单位的抗体，需要根据说明书每次抗体加入多少 ug 先算出能使用的次数，再通过总体积算出每次加入多少 ul 抗体。

2、直标的流式抗体应该4℃避光保存，不要冻，死活染料除外

第六：同型对照抗体的选择

同型对照 （Isotype Control ），是用于消除由于抗体非特异性结合到细胞PE-Cy5、PerCP、PE-Cy7 表面而产生的背景染色，是真正意义上的流式阴性对照。它不但可以用来设定流式细胞仪的电压，而且还可以帮忙省去繁琐的竞争封闭步骤。

同型对照是使用与一抗相同种属来源、相同亚型及亚链、相同荧光标记的免疫球蛋白，也要求使用相同剂量.比如同时做CD3和CD4双标检测，对应流式一抗信息与同行对照信息如下，要注意的是：几色分析就需要制备几个补偿对照管：

1    Anti human CD3-FITC（mouse igg1）    Mouse igg1-FITC    

2    Anti human cd4 -PE（igg2a）    Mouse igg2a-PE    

如果是纯化的一抗加荧光标记的二抗，那么应该选择与一抗相对应的同型对照抗体（如样品管为 ：纯化的 CD3+PE 标记的二抗+样本；则对照管为 ：纯化的同型对照+ PE 标记的二抗+样本）；

1    Anti human CD3 pure（mouse igg1） +anti mouse igg -PE    Mouse igg1+anti mouse igg -PE    

有些抗体在细胞表面或胞内表达不高，而跟其类似的抗原却非常多，那么同型对照非特异性的结合会超过抗体的特异性，就会造成同型对照表达高于抗体阳性表达的现象。这时推荐使用其他阴性对照，如空白对照等。

流式抗体选择问题借鉴了很多优秀流式技术人员的经验，希望大家能够多提建议，让流式抗体选择不再困难。如果您在流式抗体选择中遇到了疑问，可以联系我们，帮助您解决实验上的困难。