流式配色及抗体选择基本原则
随着流式细胞术应用领域的日益广泛,流式抗体及荧光标记产品的种类、数量也在不断增多,加上多色分析实验方案需求的增长,逐渐产生了抗体难选择、荧光难搭配等问题,给实验顺利开展带来了诸多困扰。流式抗体如何选择,如何配色也成为了流式技术是否能被成功应用的关键因素之一。
多色流式实验如何配色呢?
任何发荧光的物质分子都具有这两个特征光谱
第一个是激发光谱(Excitation,Ex):– 是指能特异性地激发某种荧光素的一定波长范 围内的光线,也称为吸收光谱。– 吸收波峰(最大吸收波长)。
第二个是Ex-Max 发射光谱(Emission):– 是指某一波长激发光引起荧光素发射的一定波 长范围内的荧光。 发射波峰(最大发射波长):Em-Max 发射波峰--最大发射波长。
首先要了解流式仪器的参数配置:
以双激光的流式细胞仪为例
第一、抗体配色注意强弱搭配
荧光本身有强弱之分,可视抗原表达强弱及分群情况选择合适的荧光。
高水平表达的抗原+弱荧光基团;低水平表达的抗原+强荧光基团
如抗原表达弱或分群不明显的建议选择强荧光PE ;反之,抗原表达强或分群明显的建议选择最常用的弱荧光 FITC 即可(常用荧光强弱排序为:PE>APC>PE-cy5>Percp-cy5.5>FITC );
第二、选择干扰少的荧光组合
染料之间可能存在荧光重叠,应该尽量避免。由于荧光素的宽发射谱特点,荧光通道间有光谱重叠现象,多色流式实验的时候需要通过补偿调节消除光谱重叠影响。
第三、谨慎使用串联染料
串联染料再复杂多色实验中非常必要,光照和固定都容易导致其降解,注意标准化操作以避免降解引起的实验问题(如PE/Cyanine等串联染料容易因光照而降解)
以下是常见的多色荧光抗体搭配
经典3色:FITC、PE、APC
经典4色:FITC、PE、APC、PerCP/Cyanine5.5
经典5色:FITC、PE、APC、PerCP/Cyanine5.5、PE/Cyanine7
经典6色:FITC、PE、APC、PerCP/Cyanine5.5、APC/Cyanine7、PE/Cyanine7
第四、酸性缓冲液和固定步骤对部分染料具有破环性
固定或者长时间的孵育对串联染料影响明显,FITC对低PH环境敏感。
第五:抗体的使用与保存(尽为参考,请尽量参见厂家产品说明书)
1、抗体使用的建议
① 建议实验细胞的数量和抗体的比例要适当。细胞过量或抗体过量都可能使实验结果受影响,因此需要优化试验条件
② 以test 为计量单位的抗体,按照总体积计算出每次加入多少 ul 抗体即可;
③ 以 ug 为计量单位的抗体,需要根据说明书每次抗体加入多少 ug 先算出能使用的次数,再通过总体积算出每次加入多少 ul 抗体。
2、直标的流式抗体应该4℃避光保存,不要冻,死活染料除外
第六:同型对照抗体的选择
同型对照 (Isotype Control ),是用于消除由于抗体非特异性结合到细胞PE-Cy5、PerCP、PE-Cy7 表面而产生的背景染色,是真正意义上的流式阴性对照。它不但可以用来设定流式细胞仪的电压,而且还可以帮忙省去繁琐的竞争封闭步骤。
同型对照是使用与一抗相同种属来源、相同亚型及亚链、相同荧光标记的免疫球蛋白,也要求使用相同剂量.比如同时做CD3和CD4双标检测,对应流式一抗信息与同行对照信息如下,要注意的是:几色分析就需要制备几个补偿对照管:
1 Anti human CD3-FITC(mouse igg1) Mouse igg1-FITC
2 Anti human cd4 -PE(igg2a) Mouse igg2a-PE
如果是纯化的一抗加荧光标记的二抗,那么应该选择与一抗相对应的同型对照抗体(如样品管为 :纯化的 CD3+PE 标记的二抗+样本;则对照管为 :纯化的同型对照+ PE 标记的二抗+样本);
1 Anti human CD3 pure(mouse igg1) +anti mouse igg -PE Mouse igg1+anti mouse igg -PE
有些抗体在细胞表面或胞内表达不高,而跟其类似的抗原却非常多,那么同型对照非特异性的结合会超过抗体的特异性,就会造成同型对照表达高于抗体阳性表达的现象。这时推荐使用其他阴性对照,如空白对照等。
流式抗体选择问题借鉴了很多优秀流式技术人员的经验,希望大家能够多提建议,让流式抗体选择不再困难。如果您在流式抗体选择中遇到了疑问,可以联系我们,帮助您解决实验上的困难。