检测原理
试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被肿瘤坏死因子α(TNF-α)抗体的包被微孔中,依次加入标本、标准品、HRP标记的 检测抗体,经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色,TMB在过氧化物酶的催化下转化成 蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的肿瘤坏死因子α(TNF-α)呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度(OD 值),计算 样品浓度。
样品收集、处理及保存方法
血清:使用不含热原和内毒素的试管,操作过程中避免任何细胞刺激,收集血液 后,3000 转离心 10 分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
血浆:EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000 转离心 30 分钟取上清。
细胞上清液:3000 转离心 10 分钟去除颗粒和聚合物。
组织匀浆:将组织加入适量生理盐水捣碎。3000 转离心 10 分钟取上清。
保存:如果样本收集后不及时检测,请按一次用量分装,冻存于-20℃,避免反复 冻融,在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
自备物品
酶标仪(450nm)
高精度加样器及枪头:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
37℃恒温箱
操作注意事项
试剂盒保存在 2-8℃,使用前室温平衡 20 分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结 晶,这属于正常现象,水浴加热使结晶完全溶解后再使用。
实验中不用的板条应立即放回自封袋中,密封(低温干燥)保存。
浓度为 0 的 S0 号标准品即可视为阴性对照或者空白;按照说明书操作时样本已经专业的 ELISA 试剂盒品牌 第 2 页 共 7 页 稀释 5 倍,最终结果乘以 5 才是样本实际浓度。
严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。
所有液体组分使用前充分摇匀。
试剂盒组成
名称 96 孔配置 48 孔配置 备注 微孔酶标板 12 孔×8 条 12 孔×4 条 无 标准品 0.3mL*6 管 0.3mL*6 管 无 样本稀释液 6mL 3mL 无 检测抗体-HRP 10mL 5mL 无 20×洗涤缓冲液 25mL 15mL 按说明书进行稀释 底物 A 6mL 3mL 无 底物 B 6mL 3mL 无 终止液 6mL 3mL 无 封板膜 2 张 2 张 无 说明书 1 份 1 份 无 自封袋 1 个 1 个 无 注:标准品(S0-S5)浓度依次为:0、4、8、16、32、64μg/mL 试剂的准备 20×洗涤缓冲液的稀释:蒸馏水按 1:20 稀释,即 1 份的 20×洗涤缓冲液加 19 份的 蒸馏水。
洗板方法 1. 手工洗板:甩尽孔内液体,每孔加满洗涤液,静置 1min 后甩尽孔内液体,在吸水 纸上拍干,如此洗板 5 次。 2. 自动洗板机:每孔注入洗液 350μL,浸泡 1min,洗板 5 次。
操作步骤
从室温平衡 20min 后的铝箔袋中取出所需板条,剩余板条用自封袋密封放回 4℃。
设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品 50μL;
样本孔先加待测样本 10μL,再加样本稀释液 40μL;空白孔不加。
除空白孔外,标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗 体 100μL,用封板膜封住反应孔,37℃水浴锅或恒温箱温育 60min。
弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液,静置 1min,甩去洗涤液,吸水纸上 拍干,如此重复洗板 5 次(也可用洗板机洗板)。
每孔加入底物 A、B 各 50μL,37℃避光孵育 15min。
每孔加入终止液 50μL,15min 内,在 450nm 波长处测定各孔的 OD 值。专业的 ELISA 试剂盒品牌 第 3 页 共 7 页 结果判断 绘制标准曲线:在 Excel 工作表中,以标准品浓度作横坐标,对应 OD 值作纵坐标, 绘制出标准品线性回归曲线,按曲线方程计算各样本浓度值。
试剂盒性能
准确性:标准品线性回归与预期浓度相关系数 R 值,大于等于 0.9900。
灵敏度:最低检测浓度小于 1.0μg/mL。
检测范围:1.0 - 64 μg/mL。
特异性:不与其它可溶性结构类似物交叉反应。
重复性:板内、板间变异系数均小于 15%。
贮藏:2-8℃,避光防潮保存。
有效期:6 个月
免责声明
试剂盒仅供研究使用,不得用于临床实验或人体实验,否则所产生的一切后果, 由实验者承担,本公司概不负责。
严格按照说明书操作,实验者违反说明书操作,后果由实验者承担。