实验指南

补偿调节

微球的选择及使用方法[2]关于Parameter controls，目前主要是两种主流设计方式，一种是，用我们的样本来设计单染对照；另外一种是，利用通用的补偿微球来设计；下面介绍一下各自的优缺点：

细胞

优点：真实的反映细胞的背景和指标表达情况；能适用于所有荧光缺点：个别表达量低的指标，无法保证细胞有明显分群，无法利用它来进行补偿调节。

注意事项：

      补偿对照管中使用的荧光染料应与实验中使用的试剂完全相同；

      阳性和阴性群体为同一类型细胞以确保自发荧光必须相等；

      补偿对照管里的阳性群体越亮越好；

      收集足够数量样本信息以计算得到准确的SOVs值。

补偿微球

优点：使用简单，不需要使用样本，对大多数荧光素，分群比细胞更加清晰缺点：补偿微球是细胞的替代品，并不是细胞的完美匹配，与细胞存在微小的差异，这些区别和样本以及实验有关。· 

确定抗体的宿主来源是否与微球的反应种属匹配。

 例如：Rat anti-mouse的某抗体应该选择的是anti-rat的微球。

· 

免疫Ig亚型是否不匹配？BD的微球主要反应的是Ig的Kappa链，如果是lamda链可能就不适合，反应不出来。

· 

“λ”链的抗体，这种可以选择Thermo的微球（货号：01-2222-42）做。

·

微球主要应用于抗体单染；死活染料不是抗体，所以死活染料的单染我们一般用稍微处理一下的细胞做。

· 

不管是不是胞内指标，用微球都不需要固定破膜。

· 

要用空白细胞和微球交替上机调整电压参数，确保所调的荧光通道的电压参数同时适用于细胞样本和微球，优先考虑适用细胞。
细胞直径较大的，微球可以选择plus的。

·

流式划门标准

最最关键的部分是Gating controls：Isotype and FMO

Isotypes:主要是从细胞自发荧光、FC受体和其他非特异性染色的角度来排除细胞的非特异性染色；与此同时，其中最关键的是如何来选择同型对照: 同型对照的抗体用量，一定要根据抗体和同型对照抗体的浓度，来进行换算。

如果按空白对照组设定界线之后得到的细胞比例和 FMO 设定的值有差异。以FMO为准，因为空白对照仅仅是设定阴性界线，但非阴性并不等于就是阳性，所以还需 FMO 来设定阳性界线。

生物学对照对于所有染色都是重要的，但对于具有更高背景荧光的细胞内染色更重要。生物学对照包括已知的阴性样品和已知的阳性样品。可以理解为文献中的Control或者是Vehicle组。如细胞内染色实验涉及固定和透膜，这些步骤会影响抗原检测，自发荧光，荧光素亮度和细胞形态，生物学对照显得更为重要。

注意事项：

数据分析前一定要明确自己的分析思路，一般是“两先两后”。

1. 先髓后淋：如果你的样本中包含多个细胞亚群，尤其是同时含有髓系和淋系细胞时，推荐先圈出髓系，后再髓系阴性中圈淋系，因为髓系表面的FC等受体，往往会非特异染色淋巴的抗体，先髓后淋可以获得更加准确的淋巴亚群结果。

例：先分析CD56后分析CD14，会导致CD56阳性偏高，CD14阳性偏低，而如果遵循先髓后淋的原则，结果则会更加准确：

2. 先准后不准：对于表达准确biomarker的亚群优先gate，留下不准确的亚群最后gate，这个就有点类似于排除法了，也和之前几期讲过的lin值的思路一致，先圈出准确的亚群，留下不准确的亚群进行gate，有助于我们把不准确的亚群也变得准确：

例：肺脏髓系亚群分型，作者先分出容易鉴定的Neu/EOS/mono，再进一步分析得到DC和M亚群：

第二，定门型

流式的圈门方式多种多样，十字门，矩形门，圆形门，不规则门，“随形而圈”。

1.当样本分群非常方正，单阳就是单阳，双阳就是双阳，不存在多个单阳/双阳群时，我们一般可以选择十字门进行圈门；

例：最经典的十字门就是凋亡了：

2.当样本的分群比较明显，但是存在多个单阳群，或者多个双阳群且分界清晰时，可以选择矩形门或者多边形门根据细胞的分群，形态进行圈门；

例：在分析NK细胞时，统计CD56的2个分群比例关系：

3. 当样本分群不明显时，我们需要根据其FMO或者同型FMO对照，来确定样本的阳性区间，并根据阳性区间的边界进行圈门，此时多推荐矩形门或者象限门；

三，巧统计

当我们把数据圈门按照如上所讲的思路和原则圈门完成后，接下来我们就到了统计分析的时候了，这时候我们也要注意一点，一定要对我们的数据进行合理的统计方式选择，并不是任何时候都是看一个数据的百分比了事的。

总的来说我们一般在流式里有3种统计方式，这里列出给大家参考：

1. 统计百分比：这个应该是最常见的统计方式了，针对我们圈的每一个门，我们都能看到当前门占上一个门的百分比，进而统计出整个细胞亚群中门的百分比，但是需要注意的是，如果某类细胞全部表达一个marker，那么我们就很难通过百分比来得到统计学差异了；

2. 统计平均荧光强度：针对细胞上某种蛋白的表达强度，我们不仅仅可以通过百分比统计，更是可以统计其平均荧光强度来判断样本的表达水平，这样的好处是对于某些都表达的marker，我们也可以根据其表达强弱来统计出差异性；

例：在磷酸化表达的流式实验中，通过MFI表达结果的差异性明显好于通过百分比：

3. 对于一些组织中的样本，我们可以利用绝对计数微球来统计出某些细胞占组织样本的绝对占比，从而统计出差异性，比如某个样本中，CD45+的细胞亚群比例没有太大差异，但是CD45细胞本身出现了增加或者减少，我们此时就可以通过绝对计数来发现这种现象，从而完成细微的统计分析。

04—

手动调节补偿[4]

 注意，A-B即在补偿矩阵的纵列选择A通道，横列选择B通道，大家不要弄反了哦！

理想的实验结果：

补偿调节过度针对补偿过度总结来说，我们在reviews数据时一定要去观察结果“双阴性”群，出现双阴性群往往不是真的有2个阴性群，而是我们的某些通道出现了补偿过度。